Guia para fazer um tampão fosfato simples

Em química, um amortecedorsolução serve para manter um pH estável quando uma pequena quantidade de ácido ou base é introduzida em uma solução. Uma solução tampão de fosfato é especialmente útil para aplicações biológicas, que são especialmente sensíveis às mudanças de pH, pois é possível preparar uma solução perto de qualquer um dos três níveis de pH.

Os três valores de pKa para o ácido fosfórico (do Manual de Química e Física do CRC) são 2,16, 7,21 e 12,32. O fosfato monossódico e sua base conjugada, fosfato dissódico, são geralmente usados ​​para gerar buffers de valores de pH em torno de 7, para aplicações biológicas, como mostrado aqui.

• Nota: Lembre-se de que pKa não é medido facilmente com um valor exato. Valores ligeiramente diferentes podem estar disponíveis na literatura de diferentes fontes.

A criação desse buffer é um pouco mais complicada do que os buffers TAE e TBE, mas o processo não é difícil e deve levar apenas 10 minutos.

Para fazer seu tampão fosfato, você precisará dos seguintes materiais:

• Fosfato monossódico
• Fosfato dissódico.
• Ácido fosfórico ou hidróxido de sódio (NaOH)
• medidor de pH e sonda
• Balão volumétrico
• Cilindros graduados
• Taças
• Barras de agitação
• Placa de aquecimento

Antes de fazer um buffer, você deve primeiro saber qual molaridade deseja, qual volume criar e qual é o pH desejado. A maioria dos tampões funciona melhor em concentrações entre 0,1 M e 10 M. O pH deve estar dentro de 1 unidade de pH da base ácido / conjugado pKa. Para simplificar, esse cálculo de amostra cria 1 litro de buffer.

Use a equação de Henderson-Hasselbalch (HH) (abaixo) para determinar qual proporção de ácido para base é necessária para fazer um tampão do pH desejado. Use o valor de pKa mais próximo do pH desejado; a razão refere-se ao par conjugado ácido-base que corresponde a esse pKa.

Equação HH: pH = pKa + log ([Base] / [Ácido])

Para um tampão de pH 6,9, [Base] / [Ácido] = 0,4898

Substitua por [Ácido] e Resolva por [Base]

A molaridade desejada do tampão é a soma de [Ácido] + [Base].

Para um buffer de 1 M, [Base] + [Ácido] = 1 e [Base] = 1 - [Ácido]

Substituindo isso na equação da razão, da etapa 2, você obtém:

[Ácido] = 0,6712 moles / L

Resolver para [ácido]

Usando a equação: [Base] = 1 - [Ácido], você pode calcular que:

[Base] = 0,3288 moles / L

Depois de usar o Henderson-Hasselbalch Para calcular a proporção de ácido / base necessária para o seu tampão, prepare pouco menos de 1 litro de solução usando as quantidades corretas de fosfato monossódico e fosfato dissódico.

Use uma sonda de pH para confirmar que o pH correto para o buffer foi atingido. Ajuste levemente conforme necessário, usando ácido fosfórico ou hidróxido de sódio (NaOH).

Quando o pH desejado for alcançado, leve o volume do tampão para 1 litro. Em seguida, dilua o buffer conforme desejado. Esse mesmo buffer pode ser diluído para criar buffers de 0,5 M, 0,1 M, 0,05 M ou qualquer outro meio.

Aqui estão dois exemplos de como um tampão de fosfato pode ser calculado, conforme descrito por Clive Dennison, Departamento de Bioquímica da Universidade de Natal, África do Sul.

O requisito é para um tampão Na-fosfato 0,1 M, pH 7,6.

Na equação de Henderson-Hasselbalch, pH = pKa + log ([sal] / [ácido]), o sal é Na2HPO4 e o ácido é NaHzPO4. Um buffer é mais eficaz em seu pKa, que é o ponto em que [salt] = [acid]. A partir da equação, é claro que, se o [sal]> [ácido], o pH será maior que o pKa, e se [sal]

NaH2PO4 + NaOH - + Na2HPO4 + H20.

Após a titulação da solução para o pH correto, ela pode ser diluída (pelo menos durante um pequeno para que o desvio do comportamento ideal seja pequeno) para o volume que fornecerá o valor desejado molaridade. A equação HH afirma que a proporção de sal para ácido, em vez de suas concentrações absolutas, determina o pH. Observe que:

• Nesta reação, o único subproduto é a água.
• A molaridade do tampão é determinada pela massa do ácido NaH2PO4, que é pesado, e pelo volume final no qual a solução é composta. (Para este exemplo, seriam necessários 15,60 g de di-hidrato por litro de solução final.)
• A concentração do NaOH não é preocupante, portanto qualquer concentração arbitrária pode ser usada. Obviamente, ele deve estar concentrado o suficiente para efetuar a alteração de pH necessária no volume disponível.
• A reação implica que apenas um cálculo simples de molaridade e uma única pesagem são necessários: apenas um A solução precisa ser preparada e todo o material pesado é usado no buffer - ou seja, não há desperdício.

Observe que não é correto pesar o "sal" (Na2HPO4) na primeira instância, pois isso gera um subproduto indesejado. Se uma solução do sal for preparada, seu pH estará acima do pKa e exigirá titulação com um ácido para diminuir o pH. Se HC1 for usado, a reação será:

Na2HPO4 + HC1 - + NaH2PO4 + NaC1,

produzindo NaC1, de uma concentração indeterminada, que não é desejada no tampão. Às vezes - por exemplo, em uma eluição de gradiente de força iônica de troca iônica - é necessário ter um gradiente de, digamos, [NaC1] sobreposto ao buffer. Dois buffers são então necessários, para as duas câmaras do gerador de gradiente: o buffer inicial (ou seja, o buffer de equilíbrio, sem adição de NaC1, ou com o concentração inicial de NaC1) e o tampão de acabamento, que é igual ao tampão de partida, mas que contém adicionalmente a concentração de acabamento de NaC1. Na preparação do tampão de acabamento, os efeitos de íons comuns (devido ao íon de sódio) devem ser levados em consideração.

Exemplo conforme observado na revista Biochemical Education16(4), 1988.

O requisito é um tampão de acabamento com gradiente de força iônica, tampão Na-fosfato 0,1 M, pH 7,6, contendo NaCl 1,0 M.

Nesse caso, o NaC1 é pesado e fabricado em conjunto com o NaHEPO4; efeitos de íons comuns são contabilizados na titulação e, portanto, são evitados cálculos complexos. Para 1 litro de tampão, NaH2PO4.2H20 (15,60 g) e NaC1 (58,44 g) são dissolvidos em cerca de 950 ml de H20 destilado, titulado para pH 7,6 com uma solução de NaOH bastante concentrada (mas de concentração arbitrária) e composta até 1 litro.

Exemplo conforme observado na revista Biochemical Education16(4), 1988.