Endonucleases de restrição são uma classe de enzima que cortam moléculas de DNA. Cada enzima reconhece sequências únicas de nucleotídeos em uma fita de DNA - geralmente com cerca de quatro a seis pares de bases. As sequências são palindrômicas, pois a cadeia de DNA complementar tem a mesma sequência na direção reversa. Em outras palavras, ambas as cadeias de DNA são cortadas no mesmo local.
Onde essas enzimas são encontradas
As enzimas de restrição são encontradas em muitas cepas diferentes de bactérias, nas quais seu papel biológico é participar da defesa celular. Essas enzimas restringem o DNA (viral) estranho que entra nas células, destruindo-as. As células hospedeiras têm um sistema de modificação-restrição que metila seu próprio DNA em locais específicos para suas respectivas enzimas de restrição, protegendo-as dessa clivagem. Mais de 800 enzimas conhecidas foram descobertos que reconhecem mais de 100 sequências nucleotídicas diferentes.
Tipos de enzimas de restrição
Existem cinco tipos diferentes de enzimas de restrição. O tipo I corta o DNA em locais aleatórios até 1.000 ou mais pares de bases do local de reconhecimento. O tipo III corta aproximadamente 25 pares de bases do local. Ambos os tipos requerem ATP e podem ser grandes enzimas com várias subunidades. As enzimas do tipo II, que são predominantemente usadas em biotecnologia, cortam o DNA dentro da sequência reconhecida sem a necessidade de ATP e são menores e mais simples.
As enzimas de restrição do tipo II são nomeadas de acordo com as espécies bacterianas das quais são isoladas. Por exemplo, a enzima EcoRI foi isolada de E. coli. A maioria do público está familiarizada com E. surtos de coli em alimentos.
As enzimas de restrição tipo II podem gerar dois tipos diferentes de cortes, dependendo se eles cortam ambos fios no centro da sequência de reconhecimento ou cada fio mais perto de uma extremidade do reconhecimento seqüência.
O primeiro corte irá gerar "extremidades rombas" sem saliência de nucleotídeos. O último gera extremidades "grudentas" ou "coesas" porque cada fragmento de DNA resultante tem uma saliência que complementa os outros fragmentos. Ambos são úteis na genética molecular para a produção de DNA recombinante e proteínas. Essa forma de DNA se destaca porque é produzida pela ligação (ligação) de duas ou mais cadeias diferentes que não estavam originalmente ligadas.
As enzimas do tipo IV reconhecem o DNA metilado, e as enzimas do tipo V usam RNAs para cortar sequências em organismos invasores que não são palindrômicos.
Uso em Biotecnologia
As enzimas de restrição são usadas na biotecnologia para cortar o DNA em filamentos menores, a fim de estudar as diferenças de comprimento dos fragmentos entre os indivíduos. Isto é referido como polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP). Eles também são usados para clonagem de genes.
Técnicas de RFLP foram usados para determinar que indivíduos ou grupos de indivíduos têm diferenças distintas nas seqüências de genes e padrões de clivagem de restrição em certas áreas do genoma. O conhecimento dessas áreas únicas é a base para Impressão digital de DNA. Cada um desses métodos depende do uso de eletroforese em gel de agarose para a separação dos fragmentos de DNA. O tampão TBE, composto por base Tris, ácido bórico e EDTA, é comumente usado para gel de agarose eletroforese para examinar produtos de DNA.
Uso na clonagem
A clonagem geralmente requer a inserção de um gene em um plasmídeo, que é um tipo de pedaço de DNA. As enzimas de restrição podem ajudar no processo devido às saliências de fita simples que elas deixam quando fazem cortes. A DNA ligase, uma enzima separada, pode unir duas moléculas de DNA com extremidades correspondentes.
Assim, usando enzimas de restrição com enzimas DNA ligase, pedaços de DNA de diferentes fontes podem ser usados para criar uma única molécula de DNA.