Procedimento de coloração de Gram em microbiologia

A coloração de Gram é um método diferencial de coloração usado para atribuir bactérias para um de dois grupos (gram-positivos e gram-negativos) com base nas propriedades de suas paredes celulares. Também é conhecido como coloração de Gram ou método de Gram. O procedimento recebeu o nome da pessoa que desenvolveu a técnica, o bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram.

O procedimento é baseado na reação entre o peptidoglicano nas paredes celulares de algumas bactérias. A coloração de Gram envolve a coloração de bactérias, a fixação da cor com um mordente, a descoloração das células e a aplicação de uma contracorante.

1. A mancha primária (violeta de cristal) liga-se ao peptidoglicano, colorindo as células de roxo. As células gram-positivas e gram-negativas têm peptidoglicano em suas paredes celulares; portanto, inicialmente, todas as bactérias mancham violeta.
2. Iodo de Gram (iodo e iodeto de potássio) é aplicado como mordente ou fixador. As células Gram-positivas formam um complexo de cristal violeta-iodo.
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3. Álcool ou acetona é usada para descolorir as células. As bactérias gram-negativas têm muito menos peptidoglicano em suas paredes celulares, portanto, essa etapa as torna essencialmente incolores, enquanto apenas parte da cor é removida das células gram-positivas, que possuem mais peptidoglicano (60-90% da parede celular). A parede celular espessa das células gram-positivas é desidratada pela etapa de descoloração, fazendo com que elas encolham e aprisionem o complexo mancha-iodo no interior.
4. Após a etapa de descoloração, é aplicada uma contra-mancha (geralmente safranina, mas às vezes fucsina) para colorir as bactérias de rosa. As bactérias gram-positivas e gram-negativas captam a mancha rosa, mas não é visível sobre o roxo mais escuro das bactérias gram-positivas. Se o procedimento de coloração for realizado corretamente, as bactérias gram-positivas ficarão roxas, enquanto as bactérias gram-negativas ficarão rosa.

Os resultados da coloração de Gram são visualizados usando microscopia óptica. Como as bactérias são coloridas, o grupo de coloração de Gram não é apenas identificado, sua forma, tamanho e padrão de aglomeração podem ser observados. Isso torna a mancha Gram uma valiosa ferramenta de diagnóstico para uma clínica médica ou laboratório. Embora a mancha possa não identificar definitivamente as bactérias, muitas vezes saber se são gram-positivas ou gram-negativas é suficiente para prescrever um antibiótico eficaz.

Algumas bactérias podem ser gram-variáveis ​​ou gram-indeterminadas. No entanto, mesmo essas informações podem ser úteis para diminuir a identidade bacteriana. A técnica é mais confiável quando as culturas têm menos de 24 horas. Embora possa ser usado em culturas de caldo, é melhor centrifugá-las primeiro. A principal limitação da técnica é que ela produz resultados errôneos se forem cometidos erros na técnica. Prática e habilidade são necessárias para produzir um resultado confiável. Além disso, um agente infeccioso pode não ser bacteriano. Patógenos eucarióticos coram gram-negativos. No entanto, a maioria células eucarióticas exceto que os fungos (incluindo o fermento) não aderem à lâmina durante o processo.

• Violeta de cristal (mancha primária)
• Iodo de Gram (mordente, para fixar violeta de cristal na parede celular)
• Etanol ou acetona (descolorante)
• Safranin (mancha secundária ou contracorante)
• Água em uma garrafa de esguicho ou conta-gotas
• Lâminas de microscópio
• Microscópio composto

1. Coloque uma pequena gota de amostra bacteriana em uma lâmina. O calor fixa as bactérias na lâmina, passando-a pela chama de um queimador de Bunsen três vezes. Aplicar muito calor ou por muito tempo pode derreter as paredes celulares das bactérias, distorcendo sua forma e levando a um resultado impreciso. Se aplicar muito pouco calor, a bactéria lavará a lâmina durante a coloração.
2. Use um conta-gotas para aplicar a mancha primária (violeta de cristal) na lâmina e deixe descansar por 1 minuto. Enxágue cuidadosamente a lâmina com água por mais de 5 segundos para remover o excesso de manchas. A lavagem por muito tempo pode remover muita cor, enquanto não a lavagem por tempo suficiente pode permitir que muita mancha permaneça nas células gram-negativas.
3. Use um conta-gotas para aplicar o iodo de Gram no slide e fixar o cristal violeta na parede celular. Deixe descansar por 1 minuto.
4. Enxágüe a lâmina com álcool ou acetona por cerca de 3 segundos, seguida imediatamente com um enxágue suave usando água. As células gram-negativas perderão a cor, enquanto as células gram-positivas permanecerão violetas ou azuis. No entanto, se o descolorador ficar muito tempo, todas as células perderão a cor!
5. Aplique a mancha secundária, safranina, e deixe descansar por 1 minuto. Enxágüe delicadamente com água por mais de 5 segundos. As células Gram-negativas devem estar manchadas de vermelho ou rosa, enquanto as células Gram-positivas ainda aparecerão roxas ou azuis.
6. Veja o slide usando um microscópio composto. Pode ser necessária uma ampliação de 500x a 1000x para distinguir a forma e o arranjo da célula.

Nem todas as bactérias identificadas pela mancha Gram estão associadas a doenças, mas alguns exemplos importantes incluem:

• Cocos Gram-positivos (redondos):Staphylococcus aureus
• Cocos Gram-negativos:Neisseria meningitidis
• Bacilos Gram-positivos (hastes): Bacillus anthracis
• Bacilos Gram-negativos:Escherichia coli