Amplificação de DNA através da reação em cadeia da polimerase

PCR apoia reação em cadeia da polimerase, uma técnica de biologia molecular para amplificar segmentos de DNA, gerando várias cópias usando enzimas DNA polimerase em condições controladas. Tão pouco quanto uma única cópia de um segmento ou gene de DNA pode ser clonada em milhões de cópias, permitindo a detecção usando corantes e outras técnicas de visualização.

Desenvolvido em 1983, o processo de PCR tornou possível realizar Sequenciamento de DNA e identificar a ordem dos nucleotídeos nos genes individuais. O método utiliza ciclagem térmica ou o aquecimento e resfriamento repetidos da reação para fusão e replicação do DNA. À medida que a PCR continua, o “novo” DNA é usado como modelo para replicação e ocorre uma reação em cadeia, amplificando exponencialmente o modelo de DNA.

As técnicas de PCR são aplicadas em muitas áreas da biotecnologia, incluindo engenharia de proteínas, clonagem, análise forense (impressão digital do DNA), teste de paternidade, diagnóstico de doenças hereditárias e / ou infecciosas e análise de amostras ambientais.

Na investigação forense, em particular, a PCR é especialmente útil porque amplifica até a menor quantidade de evidência de DNA. A PCR também pode ser usada para analisar DNA com milhares de anos e essas técnicas foram usadas para identificar tudo, desde um mamute de 800.000 anos até múmias de todo o mundo.

Esta etapa é necessária apenas para polimerases de DNA que requerem PCR de inicialização a quente. A reação é aquecida entre 94 e 96 ° C e mantida por 1-9 minutos.

Se o procedimento não exigir inicialização, a desnaturação é a primeira etapa. A reação é aquecida a 94-98 ° C por 20-30 segundos. As ligações de hidrogênio do modelo de DNA são interrompidas e moléculas de DNA de fita simples são criadas.

A temperatura da reação é mais baixa para entre 50 e 65 ° C e mantida por 20-40 segundos. Os iniciadores recozem no molde de DNA de fita simples. A temperatura é extremamente importante durante esta etapa. Se estiver muito quente, o primer pode não ligar. Se estiver muito frio, o primer pode se ligar imperfeitamente. Uma boa ligação é formada quando a sequência do primer corresponde à sequência do modelo.

A temperatura durante esta etapa varia dependendo do tipo de polimerase. A polimerase de DNA sintetiza uma fita de DNA completamente nova.

Este passo é realizado a 70-74 ° C por 5-15 minutos após o ciclo final de PCR.

Esta etapa é opcional. A temperatura é mantida a 4-15 ° C e interrompe a reação.

Durante cada ciclo, o produto (o pedaço específico de DNA que está sendo replicado) é duplicado.

À medida que a polimerase do DNA perde atividade e consome reagentes, a reação diminui.

Não se acumula mais produto.