Como a reação em cadeia da polimerase funciona para amplificar os genes

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica genética molecular para fazer várias cópias de um gene e também faz parte do processo de sequenciamento de genes.

As cópias do gene são feitas usando uma amostra de DNA, e a tecnologia é boa o suficiente para fazer várias cópias de uma única cópia do gene encontrado na amostra. A amplificação por PCR de um gene para fazer milhões de cópias, permite a detecção e identificação de sequências de genes usando técnicas visuais baseadas no tamanho e carga (+ ou -) do pedaço de DNA.

Sob condições controladas, pequenos segmentos de DNA são gerados por enzimas conhecidas como DNA polimerases, que adicionam desoxinucleotídeos complementares (dNTPs) a um pedaço de DNA conhecido como "modelo". Mesmo pedaços menores de DNA, chamados de "primers", são usados ​​como ponto de partida para o polimerase.

Os primers são pequenos pedaços de DNA (oligômeros) feitos pelo homem, geralmente entre 15 e 30 nucleotídeos de comprimento. Eles são feitos conhecendo ou adivinhando pequenas sequências de DNA nas extremidades do gene que está sendo amplificado. Durante a PCR, o DNA que está sendo sequenciado é aquecido e as fitas duplas se separam. Após o resfriamento, os primers se ligam ao molde (chamado de recozimento) e criam um local para o início da polimerase.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi possibilitada pela descoberta de termófilos e termófilos. enzimas polimerase (enzimas que mantêm a integridade estrutural e funcionalidade após aquecimento em alta temperaturas). As etapas envolvidas na técnica de PCR são as seguintes:

• Uma mistura é criada, com concentrações otimizadas do molde de DNA, enzima polimerase, primers e dNTPs. A capacidade de aquecer o mistura sem desnaturar a enzima permite a desnaturação da dupla hélice da amostra de DNA em temperaturas na faixa de 94 graus Celsius.
• Após a desnaturação, a amostra é resfriada a uma faixa mais moderada, em torno de 54 graus, o que facilita o anelamento (ligação) dos primers aos modelos de DNA de fita simples.
• Na terceira etapa do ciclo, a amostra é reaquecida a 72 graus, temperatura ideal para a Taq DNA Polimerase, para alongamento. Durante o alongamento, a DNA polimerase usa a fita única original de DNA como um modelo para adicionar dNTPs complementares às extremidades 3 'de cada iniciador e gerar uma seção de DNA de fita dupla na região do gene de interesse.
• Os primers que foram anelados com sequências de DNA que não são exatamente iguais não permanecem anelados a 72 graus, limitando assim o alongamento para o gene de interesse.

Este processo de desnaturação, recozimento e alongamento são repetidos várias (30-40) vezes, aumentando assim exponencialmente o número de cópias do gene desejado na mistura. Embora este processo seja bastante tedioso se realizado manualmente, as amostras podem ser preparadas e incubadas em um Termociclador programável, agora comum na maioria dos laboratórios moleculares, e uma reação PCR completa pode ser realizada em 3-4 horas.

Cada etapa de desnaturação interrompe o processo de alongamento do ciclo anterior, truncando assim a nova fita de DNA e mantendo-a aproximadamente do tamanho do gene desejado. A duração do ciclo de alongamento pode ser mais longa ou mais curta, dependendo do tamanho do gene de interesse, mas, eventualmente, por meio de ciclos repetidos de PCR, a maioria dos modelos será restrita ao tamanho do gene de interesse sozinho, uma vez que terão sido gerados a partir de produtos de ambos os primers.

Existem vários diferentes fatores para PCR bem-sucedido que pode ser manipulado para aprimorar os resultados. O método mais amplamente utilizado para testar a presença de produto de PCR é eletroforese em gel de agarose. Que é usado para separar fragmentos de DNA com base no tamanho e na carga. Os fragmentos são então visualizados usando corantes ou radioisótopos.

Desde a descoberta da PCR, outras DNA polimerases além da Taq original foram descobertas. Alguns deles têm melhor capacidade de “revisão” ou são mais estáveis ​​em temperaturas mais altas, melhorando assim a especificidade da PCR e reduzindo os erros da inserção do dNTP incorreto.

Algumas variações de PCR foram projetadas para aplicações específicas e agora são usadas regularmente em laboratórios de genética molecular. Alguns deles são PCR em tempo real e PCR por transcriptase reversa. A descoberta da PCR também levou ao desenvolvimento do sequenciamento de DNA, Impressão digital de DNA e outras técnicas moleculares.