O campo de biotecnologia é uma constante mudança. O rápido crescimento e desenvolvimento de pesquisas de ponta dependem da inovação e criatividade de cientistas e sua capacidade de ver o potencial de uma técnica molecular básica e aplicá-la a novas processos. O advento da reação em cadeia da polimerase (PCR) abriu muitas portas na pesquisa genética, incluindo um meio de Análise de DNA e identificação de diferentes genes com base em suas seqüências de DNA. O sequenciamento de DNA também depende da nossa capacidade de usar eletroforese em gel separar cadeias de DNA que diferem em tamanho em apenas um par de bases.
Sequenciação de DNA
No final da década de 1970, foram inventadas duas técnicas de seqüenciamento de DNA para moléculas de DNA mais longas: o método de Sanger (ou didesoxi) e o método de Maxam-Gilbert (clivagem química). O método Maxam-Gilbert é baseado na clivagem específica de nucleotídeos por produtos químicos e é melhor usado para sequenciar oligonucleotídeos (polímeros de nucleotídeos curtos, geralmente menores que 50 pares de bases). O método Sanger é mais comumente usado porque ficou provado que é tecnicamente mais fácil de aplicar e, com o advento da PCR e automação da técnica, é facilmente aplicado a longas cadeias de DNA, incluindo algumas genes. Esta técnica é baseada na terminação da cadeia por didesoxinucleotídeos durante as reações de alongamento da PCR.
Método Sanger
No método de Sanger, a fita de DNA a ser analisada é usada como molde e a polimerase de DNA é usada, em uma reação de PCR, para gerar fitas complementares usando primers. São preparadas quatro misturas de reação de PCR diferentes, cada uma contendo uma certa porcentagem de análogos de didesoxinucleosídeo trifosfato (ddNTP) a um dos quatro nucleotídeos (ATP, CTP, GTP ou TTP).
A síntese da nova fita de DNA continua até que um desses análogos seja incorporado, momento em que a fita é truncada prematuramente. Cada reação de PCR terminará contendo uma mistura de diferentes comprimentos de filamentos de DNA, todos terminando com o nucleotídeo que foi marcado com didesoxi para essa reação. Gel eletroforese é então usado para separar as cadeias das quatro reações, em quatro faixas separadas, e determinar a sequência do modelo original com base em quais comprimentos de cadeias terminam com qual nucleotídeo.
Na reação automatizada de Sanger, são utilizados primers marcados com quatro etiquetas fluorescentes coloridas diferentes. As reações de PCR, na presença dos diferentes didesoxinucleotídeos, são realizadas como descrito acima. No entanto, a seguir, as quatro misturas de reação são então combinadas e aplicadas em uma única pista de um gel. A cor de cada fragmento é detectada usando um raio laser e as informações são coletadas por um computador que gera cromatogramas mostrando picos para cada cor, a partir dos quais a sequência de DNA modelo pode ser determinado.
Normalmente, o método de seqüenciamento automatizado é preciso apenas para sequências de no máximo cerca de 700 a 800 pares de bases. No entanto, é possível obter seqüências completas de genes maiores e, de fato, genomas inteiros, usando métodos passo a passo, como o sequenciamento de Primer Walking e Shotgun.
No Primer Walking, uma porção viável de um gene maior é sequenciada usando o método Sanger. Novos iniciadores são gerados a partir de um segmento confiável da sequência e usados para continuar sequenciando a porção do gene que estava fora do intervalo das reações originais.
O seqüenciamento de espingarda implica em cortar aleatoriamente o segmento de DNA de interesse em mais apropriado fragmentos de tamanho (gerenciáveis), sequenciando cada fragmento e organizando as peças com base na sobreposição sequências. Esta técnica foi facilitada pela aplicação de software para organizar as peças sobrepostas.